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    水質(zhì)  蛔蟲卵的測(cè)定  沉淀集卵法

    蛔蟲卵測(cè)定適用范圍:

    本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中蛔蟲卵的沉淀集卵法。 

    本校準(zhǔn)適用于地表水和廢水中的蛔蟲卵測(cè)定。

    當(dāng)取樣體積為10L時(shí),本方法的檢出限為5個(gè)/10L(注:不銹鋼開口直壁容器應(yīng)選擇10L帶刻度)

     

    規(guī)范性引用文件

    本標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容引用了下列文件或其中的條款。凡是不注明日期的引用文件,其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

    HJ/T 91地表水和污水檢測(cè)技術(shù)規(guī)范

     

    方法原理:

    沉淀集卵法主要通過樣品的濃縮、雜質(zhì)分離、鏡檢計(jì)數(shù)等環(huán)節(jié)對(duì)水中的蛔蟲卵進(jìn)行測(cè)定。用60目全不銹鋼篩網(wǎng)過濾去除樣品中交大的雜質(zhì),利用蛔蟲卵比重大于水和易于沉淀的特性過夜沉淀濃縮水樣,用虹吸的放大棄去上清液,用表面活性劑吐溫80作為殘液及沉淀轉(zhuǎn)移時(shí)的清洗劑,進(jìn)一步離心濃縮轉(zhuǎn)移的剩余物,收集到的濃縮物用乙酸-乙酸鈉緩沖液混勻,控制溶液PH值,獲得親水-親脂平衡,加入乙酸乙酯吸收水中的脂肪類雜質(zhì),使蛔蟲卵更容易下沉。再次離心濃縮樣品并棄去上部脂肪雜質(zhì)層級(jí)緩沖液層,獲得的含卵沉淀層用飽和硝酸鈉溶液混勻,于計(jì)數(shù)框中靜置漂浮后鏡檢,即可測(cè)得水樣中蛔蟲卵的數(shù)量。

     

    配套試劑和材料:

          分析時(shí)請(qǐng)使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑,試驗(yàn)用水為新制備的蒸餾水或者去離子水。

    一:乙酸乙酯(C4H8O2       

    二:乙酸-乙酸鈉緩沖液:PH=4.5

    稱取15.0g三水合乙酸鈉(CH3COONa3H2O) ,溶于約800 ml實(shí)驗(yàn)用水中,加入3.6 ml乙酸(CH;COOH)調(diào)節(jié)pH值至4.5, 用實(shí)驗(yàn)用水定容至1000 ml。此溶液保質(zhì)期為30d。

    三:吐溫80溶液: q (C24H4O6) =1 %o

          移取1ml吐溫80(Tween80),用實(shí)驗(yàn)用水稀釋定容至1000ml,臨用現(xiàn)配。

    四:飽和硝酸鈉(NaNO3) 溶液

          稱取略多于實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度對(duì)應(yīng)溶解度的硝酸鈉(NaNO3),充分溶解于100g實(shí)驗(yàn)用水中,用濾紙濾去殘?jiān)?,臨用現(xiàn)配。硝酸鈉在不同溫度下的溶解度見附錄A。

     

    配套儀器和耗材:

          分析時(shí)如有量器請(qǐng)使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的A級(jí)量器

    一:顯微鏡:物鏡4x10倍,目鏡10x

    二:冰箱:0-4

    三:水平轉(zhuǎn)子離心機(jī):帶50ml螺口尖底離心管,離心力1000g以上

    四:漩渦混合器

    五:篩網(wǎng):60 ,孔徑250um 

    六:不銹鋼開口直壁容器10L(帶刻度

    七:開口直壁量筒:1000ml   A級(jí)

    八:虹吸管

    九:洗瓶

    十:螺口尖底離心管50ml

    十一:一次性巴氏滴管3ml10ml

    十二:微移液器:1000ul

    十三:定量計(jì)數(shù)框:1ml網(wǎng)格、5ml

     

    樣品:

    HJ/T 91中對(duì)一般污染物采樣的要求,用10 L以上容積的塑料桶采樣。采樣前需用樣品蕩洗塑料桶,采集樣品量應(yīng)≥10L,常溫下運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,立即進(jìn)行過濾(7.1)和沉淀(7.2)。

     

    分析步驟:

    一:過濾

          充分搖勻樣品,轉(zhuǎn)入不銹鋼開口直壁容器至10L刻度。如樣品中含有草梗、紙?jiān)容^大雜質(zhì),需將樣品用篩網(wǎng)過濾,并用吐溫80溶液清洗篩網(wǎng)及雜質(zhì),洗液并入過濾后的10L樣品中。

     

    二:沉淀

          上述樣品在15 C~25 C室溫下靜置過夜沉淀12 h~24 h,用虹吸管小心吸取并棄去上清液,避免擾動(dòng),保留1 L含沉淀物的樣品,轉(zhuǎn)入1000 ml開口直壁量筒,分別用50 ml吐溫80溶液*清洗不銹鋼開口直壁容器3次,洗液并入開口直壁量筒。在15 C~25 C室溫下再次靜置過夜沉淀12h~24h,用虹吸管吸取并棄去上清液,避免擾動(dòng),保留90 ml~ 100 ml含沉淀物的樣品。

     

          1:若樣品中蛔蟲卵濃度在10倍檢出限以上(>50個(gè)/10L),采樣時(shí),可只采總量不小于1L的樣品,取1L水樣直接進(jìn)行第二步的量筒沉淀濃縮。當(dāng)樣品中含有草梗、紙?jiān)容^大雜質(zhì),同樣應(yīng)先將樣品用篩網(wǎng)過濾,并用吐溫80溶液清洗篩網(wǎng)及雜質(zhì),洗液并入1 L樣品中沉淀。

     

    離心:

    沉淀濃縮后的樣品(7.2) 小心轉(zhuǎn)移至3個(gè)螺口尖底離心管,分別用15 ml 吐溫80溶液*清洗開口直壁量筒3次,洗液均勻并入3個(gè)螺口尖底離心管。以1000g 的離心力(離心機(jī)轉(zhuǎn)速計(jì)算見附錄A)離心15 min,用巴氏滴管小心吸取并棄去,上清液,少量留之,避免帶出沉淀。

          用少量吐溫80溶液將3個(gè)離心管中的沉淀進(jìn)行懸浮,將沉淀量少的2個(gè)離心管中的懸浮液并入沉淀量多的一個(gè)離心管中:分別用3 ml~ 5 ml吐溫80溶液*清洗被轉(zhuǎn)移懸浮液的2個(gè)離心管,每支清洗3次,確保沒有沉淀被丟棄,洗液并入沉淀量多的離心管。以1000g的離心力離心15min, 用巴氏滴管小心吸取并棄去上清液,少量留之,避免帶出沉淀。

     

    脂類雜質(zhì)分離去除:

    用與離心后沉淀等體積的乙酸-乙酸鈉緩沖液對(duì)沉淀進(jìn)行懸浮(:離心后沉淀體積為2 ml,加入2ml緩沖液。如果離心后沉淀體積不足2ml,加入緩沖液至4 ml。以確保用乙酸乙酯浸提后,沉淀上方有足夠體積的緩沖液,便于脂類雜質(zhì)層*傾出,且避免蛔蟲卵沉淀層的丟失。

          加入2倍離心后沉淀體積的乙酸乙酯,用渦旋混勻器*混合。以.1000g的離心力離心15 min, 樣品被分為清晰的三層。所有的非脂肪物質(zhì)、重碎片,包括蛔蟲卵、幼蟲和原生動(dòng)物在底層;中間層是緩沖液層;脂肪和其他脂溶性物質(zhì)在上方形成黑而厚的一層。

          將上層和中間層液體平穩(wěn)傾出棄去,記錄底層沉淀體積。如有必要,可用細(xì)針在離心管壁四周對(duì)上層的脂肪層進(jìn)行松動(dòng)。

     

    鏡檢:

    加入5倍底層沉淀(7.4)體積的飽和硝酸鈉溶液,對(duì)分離去除脂類雜質(zhì)后的含卵底層沉淀進(jìn)行懸浮。該懸浮液可置于0 C~4 C冰箱冷藏保存,備檢,于1周內(nèi)檢測(cè)完畢,檢測(cè)時(shí)需將其靜置至室溫。充分搖勻懸浮液,將其轉(zhuǎn)入定量計(jì)數(shù)框靜置5 min,在顯微鏡下計(jì)數(shù),直至全部懸浮液鏡檢完成。分別用1 ml飽和硝酸鈉溶液充分洗滌鏡檢完的離心管3次,將洗液轉(zhuǎn)入定量計(jì)數(shù)框,按以上步驟鏡檢。所有檢測(cè)到的蛔蟲卵全部計(jì)數(shù)。

          鏡檢時(shí),需保持環(huán)境條件的穩(wěn)定,無震動(dòng)和風(fēng)擾,緩移計(jì)數(shù)框,自上而下“U”型逐列計(jì)數(shù)?;紫x卵鑒定方法見附錄B。

     

    空白對(duì)照試驗(yàn):

    10L同批次試驗(yàn)用水,按以上采樣及分析步驟進(jìn)行全程序樣品的測(cè)定。

     

    結(jié)果計(jì)算于表示:

    計(jì)算結(jié)果:

    C------水樣中蛔蟲卵濃度(個(gè)/10L

    N-----檢測(cè)到的所有蛔蟲卵數(shù)(個(gè))

    Q-----實(shí)際水樣體積(10L

     

    結(jié)果表示:

          水質(zhì)中蛔蟲卵的測(cè)定,實(shí)驗(yàn)終結(jié)果取整數(shù),以“個(gè)/10L”為單位

     

    精密度:

    6家實(shí)驗(yàn)室分別對(duì)實(shí)際樣品和低濃度(20 個(gè)/10L)、中濃度(40 個(gè)/10L)、高濃度(80個(gè)/10L)自配樣品的蛔蟲卵進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為:6.5%~18.9%,10.1%~22.0%,12.8%~23.8%, 8.9%~ 17.4%;實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.8%5. 5%、4.9%、4.8%; 重復(fù)性限(個(gè)/10L)244、37、11;再現(xiàn)性限(個(gè)/10L)260、3、7、11。

     

    質(zhì)量保證和質(zhì)量控制:

          每批次樣品至少做1個(gè)全程序空白實(shí)驗(yàn),并取10%的樣品進(jìn)行平行樣測(cè)定,全程序空白實(shí)驗(yàn)不得檢出蛔蟲卵,平行樣間的相對(duì)偏差不得超過30%。

     

    廢物處理:

          實(shí)驗(yàn)中虹吸液煮沸10min后可按普通廢棄物處理,含乙酸乙酯的廢棄液應(yīng)集中保管,委托有資質(zhì)的單位進(jìn)行處理。

     

    注意事項(xiàng):

    實(shí)驗(yàn)用過的器具均需進(jìn)行高溫滅活,置于水中煮沸10min后方可再次使用。

          實(shí)驗(yàn)操作人員要注意自身防護(hù),試驗(yàn)時(shí)要穿戴工作服、乳膠手套、及口罩等,同時(shí)還要避免蛔蟲卵的樣品污染實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

     

     

     

     

     

    附錄A

    硝酸鈉水中溶解度、離心機(jī)離心力及轉(zhuǎn)速計(jì)算公式

    A.1  硝酸鈉在水中的溶解度

    A.1   硝酸鈉水中溶解度

    溫度(℃)

    溶解度(g

    0

    73

    10

    80

    20

    87

    30

    95

    40

    103

    A.2離心力計(jì)算公式:

     

    附錄B

    蛔蟲卵的檢定

    B.1蛔蟲卵的形態(tài)特征

    B.1.1受精蛔蟲卵

          蟲卵呈短橢圓形,大小為45 μm~75 μmx35 μm~ 50 μm。卵殼很厚,自外向內(nèi)分為三層:受精膜、殼質(zhì)層和蛔甙層,殼質(zhì)層較厚,另兩層極薄,在普通顯微鏡下難以分清。卵殼內(nèi)有一個(gè)大而圓未分裂的受精卵細(xì)胞,與卵殼間常見有新月形空隙。卵殼外有一層由蟲體子宮分泌形成的蛋白質(zhì)膜,其表面凹凸不平呈波浪狀。隨糞便排出的蟲卵常被膽汁染成黃色或棕褐色。

     

    B.1.2未受精蛔蟲卵

          蟲卵呈長(zhǎng)橢圓形或不規(guī)則形,大小為88 μm~94 μmx39 μm ~44 μm,卵殼與蛋自質(zhì)膜均較受精蛔蟲卵薄,淡黃色,無蛔甙層,卵殼內(nèi)含有許多大小不一的屈光顆粒。

     

    B.1.3感染期蛔蟲卵

          卵內(nèi)含有一.條卷曲的幼蟲。

     

    B.1.4蛋白質(zhì)膜脫落的蛔蟲卵

          若蛔蟲卵的蛋白質(zhì)膜脫落,卵殼則呈無色透明,應(yīng)注意與其他線蟲卵的鑒別。

     

    B.2蛔蟲卵參考圖片

    B.2.1蛔蟲卵模式圖

     

    B.2.2發(fā)育各階段的蛔蟲卵

     

    附錄C

    蛔蟲卵配置樣品的制備

    豬蛔蟲(Ascaris suum)活成蟲采集自屠宰場(chǎng),用蒸餾水洗滌干凈后,放置于含4 %甲醛溶液內(nèi),0 C~4 C保存?zhèn)溆?,可長(zhǎng)期保存。

     

          制備蛔蟲卵備用液時(shí),選取2~3條雌性蛔蟲,用75 %乙醇消毒過的解剖刀,劃開蟲體,每條蛔蟲一- 對(duì)子宮選取靠近陰門的一段(2 mm~3 mm),解剖后,將含蛔蟲卵的內(nèi)容物及組織碎片放入50ml離心管中,加入數(shù)顆直徑1mm玻璃珠及10ml生理鹽水,混勻后于渦旋混勻器振蕩3min~5min,260目網(wǎng)過篩,取40ml生理鹽水分?jǐn)?shù)次沖洗離心管和篩網(wǎng),此時(shí)獲得的濾液中蛔蟲卵呈單個(gè)狀態(tài)存在。濾液加入甲醛至終濃度為4%,0 C~4 C保存?zhèn)溆?,可保?/span>1個(gè)月。即制即用時(shí)可不添加甲醛。

     

          制備配制樣品時(shí),搖勻蛔蟲卵備用液,用1000 μ1微量移液器,立即吸取適量的蛔蟲卵備用液于1ml定量計(jì)數(shù)框(網(wǎng)格)中,計(jì)數(shù)后用250μl微量移液器向計(jì)數(shù)框中添加或移出蛔蟲卵至所需數(shù)量。將計(jì)數(shù)框中所有的液體用吐溫80溶液沖洗入配制樣品中。再在顯微鏡下檢測(cè)計(jì)數(shù)框,確保無蛔蟲卵殘留。

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